実験手法解説

【プロトコル付き】付着細胞の継代方法について解説します

・継代のプロトコルがわからない

・継代って何をすればいいの?何が必要なの?

こんにちは。Hiro(@THiro70217938)です。

この記事では、細胞培養を始めたけど「まだ継代に慣れていない」、「次の継代までに復習したいな」と思っている人や、「これから細胞培養をはじめる」といった人に向けて継代に必要な試薬と方法をまとめています。

用意する試薬

・PBS(-) *オートクレーブ済みのもの

・トリプシン-EDTA

トリプシンに関する記事はこちら

・培地(medium) *FBSや抗生物質を添加したもの

FBSに関する記事はこちら

・トリパンブルー(必要なひとだけ)

操作

1. 試薬を室温に戻しておく

2. 顕微鏡により細胞の状態を観察する

*80~90%コンフルエントがのぞましい

3. 容器(ディッシュやフラスコ)から培地を除去する

*容器を傾け、細胞に触れないように作業を行う

4. PBS(-)を加えて容器に残った培地を洗い、PBS(-)を除去する

*2回行う

*PBS(-)による洗浄が不十分だと、トリプシンの作用が弱くなるためしっかり洗浄する

5. トリプシン-EDTAを加えてインキュベートする

*トリプシン-EDTAは細胞表面が浸るくらいの量で十分

*トリプシンを使う理由や注意点はこちら

6. 顕微鏡で細胞が丸くなりはがれているかを確認する

*2~10分が目安(細胞種によってことなる)

*インキュベート時間が長くなると細胞に悪影響がでるため、はがれたらすぐ次の操作に移ること

7. 軽く容器をタッピングし細胞をはがす

8. FBS入りの培地を加え、ピペッティングにより細胞を完全にはがし均一に分散させる

*FBSによってトリプシンの反応が止まるので、必ずFBS入りの培地を使うこと

9. 細胞懸濁液を新しいtubeに移し遠心する(1000 rpm, 3~5分程度)

10. 適量の培地で細胞を懸濁する

11. 細胞数を計測する

*トリパンブルーを使うことで死細胞を見分けることができる(青い細胞=死細胞)

細胞数の計測方法はこちら

12. 新しい容器に培地と細胞を適量加える

*細胞数は細胞種によって異なる

13. 容器を揺らし細胞を均一にする

14. 顕微鏡で細胞が均一になっていることを確認する

15. CO2インキュベーター内で次回継代まで細胞を飼育する

試薬調整法

PBS(-)

1 L調整時
・リン酸二水素カリウム(KH2PO4)0.2 g
・リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)1.15 g
あるいはリン酸水素二ナトリウム12水和物(Na2HPO4・H2O) 2.90 g
・塩化カリウム(KCl) 0.2 g
・塩化ナトリウム(NaCl) 8 g

参考動画

細胞培養テクニカル動画(YouTube)3:57からご視聴ください

汎用細胞株情報まとめ

汎用細胞の情報をまとめました(RIKENへのリンクです)。

細胞培養時の参考としてお使いください。

A549(ヒト肺癌細胞)

C2C12(マウス筋芽細胞)

COS7(アフリカミドリザル腎細胞)

HEK293(ヒト胎児腎細胞)

HEK293T(ヒト胎児腎細胞)

HeLa(ヒト子宮頸部がん細胞)

HepG2(ヒト肝癌細胞)

NB2a(Neuro2A)(マウス神経芽細胞腫)

NIH 3T3(マウス線維芽細胞様細胞)

PC-12(ラット副腎髄質褐色腫)

RAW264(マウスマクロファージ様細胞)

RBL2H3(ラット好塩基性白血病細胞由来)

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細胞培養の基礎知識全般を抑えたい人は「【細胞培養初心者向け】細胞培養の基礎知識を解説!」をご覧ください。

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