【プロトコル付き】付着細胞の継代方法について解説します

・PBS(-)　＊オートクレーブ済みのもの

・トリプシン-EDTA

トリプシンに関する記事はこちら

・培地（medium）　＊FBSや抗生物質を添加したもの

FBSに関する記事はこちら

・トリパンブルー（必要なひとだけ）

１．　試薬を室温に戻しておく

２．　顕微鏡により細胞の状態を観察する

＊80～90%コンフルエントがのぞましい

３．　容器（ディッシュやフラスコ）から培地を除去する

＊容器を傾け、細胞に触れないように作業を行う

４．　PBS(-)を加えて容器に残った培地を洗い、PBS(-)を除去する

＊2回行う

＊PBS(-)による洗浄が不十分だと、トリプシンの作用が弱くなるためしっかり洗浄する

５．　トリプシン-EDTAを加えてインキュベートする

＊トリプシン-EDTAは細胞表面が浸るくらいの量で十分

＊トリプシンを使う理由や注意点はこちら

６．　顕微鏡で細胞が丸くなりはがれているかを確認する

＊２～10分が目安（細胞種によってことなる）

＊インキュベート時間が長くなると細胞に悪影響がでるため、はがれたらすぐ次の操作に移ること

７．　軽く容器をタッピングし細胞をはがす

８．　FBS入りの培地を加え、ピペッティングにより細胞を完全にはがし均一に分散させる

＊FBSによってトリプシンの反応が止まるので、必ずFBS入りの培地を使うこと

９．　細胞懸濁液を新しいtubeに移し遠心する（1000 rpm, 3～5分程度）

１０．　適量の培地で細胞を懸濁する

１１．　細胞数を計測する

＊トリパンブルーを使うことで死細胞を見分けることができる（青い細胞＝死細胞）

＊細胞数の計測方法はこちら

１２．　新しい容器に培地と細胞を適量加える

＊細胞数は細胞種によって異なる

１３．　容器を揺らし細胞を均一にする

１４．　顕微鏡で細胞が均一になっていることを確認する

１５．　CO₂インキュベーター内で次回継代まで細胞を飼育する

1 L調整時
・リン酸二水素カリウム（KH₂PO₄）0.2 g
・リン酸水素二ナトリウム（Na₂HPO₄）1.15 g
あるいはリン酸水素二ナトリウム12水和物（Na₂HPO₄・H₂O）　2.90 g
・塩化カリウム（KCl）　0.2 g
・塩化ナトリウム（NaCl）　8 g