免疫染色

免疫染色の手順・プロトコル

免疫染色のプロトコルを紹介するよ!

ここでは免疫染色のプロトコルを紹介します。

私が実際使っているプロトコルと試薬を載せているので、参考にしながらみなさんの実験に合うようにカスタマイズしてくださいね。

  • 蛍光染色法
  • 酵素抗体法(ABC法)

の2種類の方法を取り扱っています。

(フローティング法を後日追加予定です。)

蛍光染色法

プロトコル

  1. 10~30 μmの凍結切片を使用
  2. PBS, 5分×2回, 【洗浄】
  3. 4% PFA/PBS, 5分, 室温,  【固定】
  4. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  5. 0.3% TritonX-100/PBS, 30分,  室温, 【透過処理】
  6. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  7. 10 mM クエン酸バッファー(pH=6.0), 40分, 90℃, 【抗原賦活化】
  8. 室温で静置, 30分
  9. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  10. 撥水ペンで切片を囲む
  11. 10% FBS/PBS, 1時間,  室温, 【ブロッキング】
  12. 一次抗体( in 10% FBS/PBS ), over night, 4℃, 【抗体反応】
  13. 0.2% tween20/PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  14. 蛍光標識二次抗体( in 10% FBS/PBS ), 1時間, 室温, 【抗体反応】
    *ここからは遮光条件下でインキュベートを行う
  15. 0.2% tween20/PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  16. PBS, 5分×1回, 【洗浄】
  17. 褪色防止剤入りの封入剤を用いて封入する

試薬など(参考)

撥水ペン
・Super PAP Pen(大道産業)

封入剤
・Fluoromount-G(Southern Biotech)

酵素抗体法(ABC法)

プロトコル

  1. 0.5% HCl / EtOH 2 min10~30 μmの凍結切片を使用
  2. PBS, 5分×2回, 【洗浄】
  3. 4% PFA/PBS, 5分, 室温,  【固定】
  4. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  5. 0.3% TritonX-100/PBS, 30分,  室温, 【透過処理】
  6. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  7. 10 mM クエン酸バッファー(pH=6.0), 40分, 90℃, 【抗原賦活化】
  8. 室温で静置, 30分
  9. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  10. 撥水ペンで切片を囲む
  11. 10% FBS/PBS, 1時間,  室温, 【ブロッキング】
  12. 一次抗体( in 10% FBS/PBS ), over night, 4℃, 【抗体反応】
  13. 0.2% tween20/PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  14. ビオチン標識二次抗体( in 10% FBS/PBS ), 30分, 室温, 【抗体反応】
    *キット付属二次抗体を使用
  15. PBS, 5分×1回, 【洗浄】
  16. 0.3%過酸化水素/メタノール, 15分, 室温, 【内在性ペルオキシダーゼ不活化】
  17. PBS, 5分×3回, 【洗浄】
  18. ABC溶液, 30分, 室温, 【ABC反応】
    *キット付属試薬を使用
  19. PBS, 5分×1回, 【洗浄】
  20. ImmPACT DAB soln., 1-30分(sampleに応じて), 室温, 【発色反応】
  21. PBS, 5分×1回, 【洗浄】
  22. 1% メチルグリーン/95%エタノール, 2分, 室温, 【核染色】
  23. 水道水, 簡単に洗浄
  24. 0.5%塩酸/エタノール, 2分, 【分別】
  25. 75%エタノール, 1分, 【脱水】
  26. 85%エタノール, 1分, 【脱水】
  27. 95%エタノール, 1分, 【脱水】
  28. 100%エタノール, 1分×3回, 【脱水】
  29. キシレン, 1分×5回, 【透徹】
  30. 封入する

試薬など(参考)

ABC染色キット
・VECTASTAIN ABC Kit(VECTOR LABORATORIES)

DAB(発色基質)
・ImmPACT DAB Substrate(VECTOR LABORATORIES)

封入剤(非水系)
・エンテランニュー(MERCK)

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免疫染色の各工程の解説記事

プロトコル内にわからない工程がある場合は以下の記事で原理を解説しています。

ぜひ参考にしてください。

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