RNA work

RNA抽出からPCRまでの流れを解説します【RNA抽出まとめ記事】

この記事では遺伝子発現解析の大きな流れについて簡単に説明をしていきます。詳細については随時記事を追加してリンクを貼りますので、記事の作成が完了するまでしばしお待ちください。

先ずは、RNA発現解析までの大きな流れです。以下の通りとなります。

Sampleの準備

第一段階では、解析対象となるsampleの準備をします。例えば薬物Aの遺伝子発現に対する効果を調べたいのであれば、薬物Aを投与したマウスと対照(コントロール)として薬物を投与していないマウス(正確には溶媒を投与したマウス)を準備します。これがsampleの準備段階となります。しっかり実験をデザインして過不足ないsampleを用意する必要があります。

RNAの抽出・精製

ここでは、対象の組織や細胞からRNAを抽出します。RNAは分解されやすいので様々な点に注意してこの作業を行います。また、組織や細胞中にはRNA以外にも多くの物質が含まれているので、RNA以外のものを除去しRNAのみを精製します。代表的なものとしてAGPC法というものがあります。

RNAを分解から守る方法と考え方~解説記事~この記事では、RNAを扱う上での注意事項を説明してきます。RNAはとても分解しやすいので、注意事項を抑えて作業をすることがきれいなRNA...
フェノールクロロホルム抽出によるRNA分離イメージ
フェノールクロロホルム抽出の原理【図解付きでやさしく原理を解説】 ・フェノールクロロホルム抽出ってなに? ・なぜフェノールクロロホルム抽出でRNAを分離することができるの? ・クロロ...
アルコール沈殿の原理 ~アルコール沈殿の原理や豆知識をイラスト付きで解説~アルコール沈殿とは 核酸(DNA、RNA)を精製、濃縮する方法である。核酸をアルコールと塩で凝集させて沈殿を得ることにより行う。アルコ...
RNA sampleを雑に扱うとどうなるのか ~手と唾液によるRNAの分解~今日は面白い記事を見つけたので紹介していきます。以前の記事でRNAの分解の防ぎ方を紹介しました。そこでも書きましたが、私はRNase(R...

RNAの質と量の確認

この作業では、精製したRNAのクオリティーを確認します。抽出・精製で書いたようにRNAは分化されやすいので、得られたRNAが分解されていないかを確認します。また、どれだけの量のRNAが得られたのか、夾雑物(有機溶媒やタンパク質)が混入していないかもここでチェックをします。RNAの分解の確認は電気泳動を、量と夾雑物の確認には吸光度測定を利用します。

吸光度による核酸濃度・純度の測定 ~DNAとRNA濃度・純度測定におけるポイントを解説します~この記事では、吸光度計(NanoDrop)を使った核酸(DNA・RNA)濃度・純度の測定を行う際のポイントと注意点を解説します。 ...
RNA電気泳動法の解説 ~RNA電気泳動の意義や原理を解説します~この記事では、古典的なアガロースゲルを用いたRNA電気泳動の方法と基本的な知っておいた方がよいポイントを解説していきます。 最近は...

逆転写

ここまでで、実験に使用できるクオリティーのRNAが得られたら、得られたらRNAを鋳型(template)として、逆転写を行います。逆転写とはRNAをもとにして対応するDNAをつくる反応ことです。ここでPCR反応に用いるDNAを作製します。

Primerの設計・作製

逆転写によってPCRに用いるDNAが用意できるのですが、PCRを行うためにはこれに加えてprimerを用意しなければいけません。Primerは解析したい遺伝子に応じて専用のものを作る必要があります。また、正確な実験結果を得るためにはprimerの設計におけるルールをいくつか知っておく必要があります。別の記事で私のおすすめのprimer設計サイトである「Primer-BLAST」の使い方についても別の記事で解説していますので、是非ご覧ください。

Primer-BLASTリンク:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Primer-BLASTの使い方を完全図解解説 ~Primer-BLASTの超基本的な使用方法~Primerの設計ツールであるPrimer-BLASTの使い方を図解で解説します。Primer-BLASTは無料で使いやすいのでおすすめ...

PCR

ここまでくればお待ちかねのPCRとなります。PCRを行うことで目的の遺伝子の量を正確に調べることができます。より正確に定量を行う場合には一般的にReal Time PCRを行います。

【図解付き】初心者向けにPCRの原理をわかりやすく解説しますこんにちは! 今回はPCRの原理を図解付きで初心者向けに解説します。 ・PCRをこれから始めるひと ・PCRをして...
【先ずはここから】PCR初心者向け勉強用書籍(本)3選 【PCRの勉強をしよう】研究を始めたてで、PCRと関連手法が全く分からない、今まで何となくやってきたけどちゃんと勉強したい、という方向けに初心者向けのおすすめ書...

結果の解析・統計処理

PCRが終われば実験終了ではなくて、結果を解釈するために解析と統計処理を行います。難しくはないですが、計算を行い正しいデータを作成していきます。基本的にはExcelを使って作業をすることになると思います。ここで間違えてしまうと、頑張ってやった実験が台無しになり、しかも間違いに気が付かないということもありますので、しっかり理解をした上で正しい解析をする必要があります。

まとめ

以上がおおまかなRNA発現解析の流れとなります。すべてのステップのいずれが欠けても実験がうまくいかなくなってしまうので、しっかり勉強をして実験を行ってください。