分子生物学実験

Primer-BLASTの超基本的な使い方を解説【豊富な画像付き】

Primerの設計ツールであるPrimer-BLASTの使い方を図解で解説します。Primer-BLASTは無料で使いやすいのでおすすめのサイトです。私もPrimer-BLASTを利用して、primerを設計しています。全く使い方がわからない、とりあえず使ってみたいという人は、この記事で説明している通りに一度使ってみてください。ここでは、Real time PCRに使用することを想定して説明していきます。

先ずは、Primer-BLASTのサイトに行きます。

Primer-BLASTと検索すればすぐにでできます。

サイトに入ってみましょう。

すると下図のようなサイトが表示されます。

ここではまだ、Primer-BLASTは使用せずに下準備をします。

次にPubmedのGeneにいきます。

先ずPubmedのページに行きます。

ページの一番下に行くとGeneが見つかるのでクリックします。

primerのターゲットにする遺伝子名と使用する動物種を入力します。

Searchをクリックします。

目的の遺伝子が表示されるので、動物種が入力したものと一致しているかを確認して、遺伝子名をクリックします。

動物種は学術名で表示されるので注意してください。

すると下図のような画面が表示されます。

サイトを下にスクロールしていくと真ん中から下のあたりに、「mRNA and Protein(s)」という項目が見つかります。

ここに記載されているNM_・・・をメモします。

スプライシングバリアントが存在する場合は複数表示されます。目的のものを利用してください。詳細はここでは説明しません。)

ここまでできたら、Primer-BLASTに戻ります。

ここからはサイトの上の方から必要事項を入力していきます。

先ずはPCR Templateの空欄部分に先ほどメモしたNM_・・・を入力します。

次にPrimer ParametersのPCR product sizeの値を修正します。

MinとMaxの部分にPCR産物のサイズの上限値と下限値を入力します。Real time PCRに使用する場合は、MinはそのままMaxは200にしておきましょう。

続いてExon/intron selectionです。

Intron inclusionにチェックを入れます。これによりprimerで増幅される領域にイントロンが含まれます。(ゲノムDNA由来の産物を区別することができます。)

次に、Intron length rangeの入力をします。ここでは増幅されるイントロンの大きさを定義します。Minを100にし、Maxはそのままでよいでしょう。

続いてPrimer Pair Specificity Checking Parametersの入力です。

Organismの欄に入力をします。デフォルトでHomo sapiensが入力されていますが、ここには使用する動物種の学術名を入力します。入力をすると候補が表示されるので該当するものをクリックして選択します。

最後に下の画像に示すShow results in a new windowにチェックを入れて、Get Primersをクリックします。

すると下のような画面が表示されます。しばらくするとprimerの設計結果が表示されます(2~3分ほどです)。

結果の代わりに下のような画面が表示されることがあります。

簡単にいうと似たような遺伝子があるけど大丈夫か?という確認の画面になります。

画面に今回標的にしている遺伝子と同じ遺伝子名が表示されている場合は、XM_で始まるものだと問題はないのでチェックボックスをクリックしてSubmitをクリックします。

ほとんどの場合はこのパターンになります。

すると、下のような画面が表示されます。この画面が表示されていれば設計完了になります。

あとは、Detailed primer reportsのPrimer pairのSequenceに書かれている配列が、設計されたprimerの配列になります。

複数のprimer pairの候補が表示されますが、先ずは1を使ってみればよいと思います。これにて終了になります。

いかがでしたでしょうか。この通りに作業をすれば簡単にprimerを設計することができます。ここで紹介しているのは超初歩になります。使っていくと、色々追加で知らなければいけないことが出てきますが、使いながら勉強してみてください。

もし要望が多いようでしたら、応用的な使い方やトラブルシューティングについても解説しますので、コメントをください。

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